慶応元年（1865年）、京の薩摩藩邸に移った龍馬の元に中岡慎太郎らが訪問。この頃から中岡と共に薩長同盟への運動を開始する。薩摩藩の援助により、土佐脱藩の仲間と共に長崎で社中（亀山社中・のちに海援隊）を組織し、物産・武器の貿易を行った。8月、龍馬は、薩摩藩名義で香港のジャーディン・マセソン商会の信用状により長崎のグラバー商会から買い付けた銃器弾薬を長州藩に転売することに成功した。この年、「非義勅命は勅命にあらず」という文言で有名な大久保利通の書簡を、長州藩重役に届けるという重大な任務を龍馬が大久保や西郷に任されている[12]。
慶応2年（1866年）、1月、坂本龍馬の斡旋により、京都で長州の桂小五郎（木戸孝允）と薩摩の西郷隆盛が会見し、薩長同盟（薩長盟約）が結ばれた。このとき龍馬は桂に求められて盟約書の裏書を行っている。天下の大藩同士の同盟に一介の素浪人が保証を与えたものであって、彼がいかに信を得ていたかがわかる[13]。直後の2月、寺田屋で幕吏に襲撃されたが一命を取り留める。その傷を癒すため、妻おりょうと共に鹿児島を旅行する。6月、第二次長州征伐では亀山社中の船・乙丑丸で長州藩海軍を支援。
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